Strukturen der RNA-Polymerase des Influenza-A-Virus bieten Einblicke in die Replikation des viralen Genoms

Nature Band 573, Seiten 287–290 (2019)Diesen Artikel zitieren

16.000 Zugriffe

101 Zitate

137 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Influenza-A-Viren sind für saisonale Epidemien verantwortlich, und durch die Übertragung neuartiger zoonotischer Influenza-A-Viren auf den Menschen können Pandemien entstehen1,2. Influenza-A-Viren enthalten ein segmentiertes Negativ-RNA-Genom, das von der viral-RNA-abhängigen RNA-Polymerase (FluPolA), bestehend aus PB1-, PB2- und PA-Untereinheiten, transkribiert und repliziert wird3,4,5. Obwohl bereits über die hochauflösende Kristallstruktur von FluPolA des Fledermaus-Influenza-A-Virus berichtet wurde6, sind für menschliches und aviäres FluPolA keine vollständigen Strukturen verfügbar. Darüber hinaus sind die molekularen Mechanismen der Replikation genomischer viraler RNA (vRNA), die über ein komplementäres RNA (cRNA) replikatives Zwischenprodukt abläuft und eine Oligomerisierung der Polymerase7,8,9,10 erfordert, weitgehend unbekannt. Hier bestimmen wir mithilfe von Kristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie die Strukturen von FluPolA aus menschlichen Influenzaviren A/NT/60/1968 (H3N2) und Vogelgrippeviren A/duck/Fujian/01/2002 (H5N1) mit einer Auflösung von 3,0 –4,3 Å, in Gegenwart oder Abwesenheit einer cRNA- oder vRNA-Matrize. In Lösung bildet FluPolA Dimere von Heterotrimeren über die C-terminale Domäne der PA-Untereinheit, die Daumen-Subdomäne von PB1 und die N1-Subdomäne von PB2. Die kryoelektronenmikroskopische Struktur von an die cRNA-Matrize gebundenem, monomerem FluPolA zeigt eine Bindungsstelle für die 3′-cRNA an der Dimer-Grenzfläche. Wir verwenden eine Kombination aus zellbasierten und In-vitro-Assays, um zu zeigen, dass die Schnittstelle des FluPolA-Dimers für die vRNA-Synthese während der Replikation des viralen Genoms erforderlich ist. Wir zeigen auch, dass ein Nanokörper (ein Einzeldomänen-Antikörper), der die FluPolA-Dimerisierung stört, die Synthese von vRNA und folglich die Virusreplikation in infizierten Zellen hemmt. Unsere Studie liefert hochauflösende Strukturen von medizinisch relevantem FluPolA sowie Einblicke in die Replikationsmechanismen des viralen RNA-Genoms. Darüber hinaus identifiziert unsere Arbeit Stellen in FluPolA, die bei der Entwicklung antiviraler Medikamente ins Visier genommen werden könnten.

Dies ist eine Vorschau der Abonnementinhalte, Zugriff über Ihre Institution

Open-Access-Artikel, die diesen Artikel zitieren.

Wissenschaftliche Berichte Open Access 29. April 2023

Wissenschaftliche Berichte Open Access 07. März 2023

Nature Communications Open Access 11. Februar 2023

Greifen Sie auf Nature und 54 weitere Nature Portfolio-Zeitschriften zu

Holen Sie sich Nature+, unser preisgünstigstes Online-Zugangsabonnement

29,99 $ / 30 Tage

jederzeit kündigen

Abonnieren Sie diese Zeitschrift

Erhalten Sie 51 gedruckte Ausgaben und Online-Zugriff

199,00 $ pro Jahr

nur 3,90 $ pro Ausgabe

Leihen oder kaufen Sie diesen Artikel

Die Preise variieren je nach Artikeltyp

ab 1,95 $

bis 39,95 $

Die Preise können örtlicher Steuern unterliegen, die beim Bezahlvorgang berechnet werden

Alle Daten sind bei den entsprechenden Autoren erhältlich und/oder im Manuskript oder in den Zusatzinformationen enthalten. Atomkoordinaten wurden im PDB mit den Zugangscodes 6QNW (H3N2 FluPolA), 6QPF (H5N1 FluPolA) und 6QPG (H3N2 FluPolA + Nb8205) hinterlegt. Kryo-EM-Dichtekarten wurden in der Electron Microscopy Data Bank mit den Zugangscodes EMD-4661 (monomeres H3N2 FluPolA + cRNA + Nb8205), EMD-4663 und EMD-4664 (dimeres H3N2 FluPolA + cRNA) und EMD-4666 (dimeres H3N2 FluPolA + cRNA + Nb8205) hinterlegt H3N2 FluPolA + cRNA + Nb8205), EMD-4660 (monomeres FluPolB + cRNA) und EMD-4986 (monomeres H3N2 FluPolA + vRNA + capped RNA) mit den entsprechenden Atomkoordinaten, hinterlegt im PDB mit den Zugangsnummern 6QX3, 6QX8, 6QXE, 6QWL bzw. 6RR7.

Taubenberger, JK & Kash, JC Evolution des Influenzavirus, Wirtsanpassung und Pandemiebildung. Cell Host Microbe 7, 440–451 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Mostafa, A., Abdelwhab, EM, Mettenleiter, TC & Pleschka, S. Zoonotisches Potenzial von Influenza-A-Viren: ein umfassender Überblick. Viren 10, 497 (2018).

Artikel Google Scholar

Pflug, A., Lukarska, M., Resa-Infante, P., Reich, S. & Cusack, S. Strukturelle Einblicke in die RNA-Synthese durch die Transkriptions-Replikationsmaschine des Influenzavirus. Virus Res. 234, 103–117 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

te Velthuis, AJ & Fodor, E. Influenzavirus-RNA-Polymerase: Einblicke in die Mechanismen der viralen RNA-Synthese. Nat. Rev. Microbiol. 14, 479–493 (2016).

Artikel Google Scholar

Walker, AP & Fodor, E. Zusammenspiel zwischen Influenzavirus und der Transkriptionsmaschinerie der RNA-Polymerase II des Wirts. Trends Mikrobiol. 27, 398–407 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Pflug, A., Guilligay, D., Reich, S. & Cusack, S. Struktur der Influenza-A-Polymerase, die an den viralen RNA-Promotor gebunden ist. Natur 516, 355–360 (2014).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Jorba, N., Coloma, R. & Ortín, J. Die genetische Transkomplementierung etabliert ein neues Modell für die Transkription und Replikation von Influenzavirus-RNA. PLoS Pathog. 5, e1000462 (2009).

Artikel Google Scholar

York, A., Hengrung, N., Vreede, FT, Huiskonen, JT & Fodor, E. Isolierung und Charakterisierung des positivsinnigen replikativen Zwischenprodukts eines Negativstrang-RNA-Virus. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 110, E4238–E4245 (2013).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Jorba, N., Area, E. & Ortín, J. Oligomerisierung des Influenzavirus-Polymerasekomplexes in vivo. J. General Virol. 89, 520–524 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Moeller, A., Kirchdoerfer, RN, Potter, CS, Carragher, B. & Wilson, IA Organisation der Influenzavirus-Replikationsmaschinerie. Science 338, 1631–1634 (2012).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Chang, S. et al. Kryo-EM-Struktur des Influenzavirus-RNA-Polymerase-Komplexes bei 4,3 Å Auflösung. Mol. Zelle 57, 925–935 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Hara, K., Schmidt, FI, Crow, M. & Brownlee, GG Aminosäurereste in der N-terminalen Region der PA-Untereinheit der RNA-Polymerase des Influenza-A-Virus spielen eine entscheidende Rolle bei der Proteinstabilität, Endonukleaseaktivität, Cap-Bindung, und Bindung des Virion-RNA-Promotors. J. Virol. 80, 7789–7798 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Mänz, B., Brunotte, L., Reuther, P. & Schwemmle, M. Adaptive Mutationen in NEP kompensieren fehlerhafte H5N1-RNA-Replikation in kultivierten menschlichen Zellen. Nat. Komm. 3, 802 (2012).

Artikel ADS Google Scholar

Deng, T., Vreede, FT & Brownlee, GG Verschiedene De-novo-Initiationsstrategien werden von der Influenzavirus-RNA-Polymerase auf ihrer cRNA und viralen RNA-Promotoren während der viralen RNA-Replikation verwendet. J. Virol. 80, 2337–2348 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Hengrung, N. et al. Kristallstruktur der RNA-abhängigen RNA-Polymerase aus dem Influenza-C-Virus. Natur 527, 114–117 (2015).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Thierry, E. et al. Influenza-Polymerase kann eine alternative Konfiguration annehmen, die eine radikale Umpackung von PB2-Domänen beinhaltet. Mol. Zelle 61, 125–137 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Serna Martin, I. et al. Ein Mechanismus zur Aktivierung der Influenzavirus-Transkriptase. Mol. Zelle 70, 1101–1110 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Reich, S. et al. Strukturelle Einblicke in das Cap-Snatching und die RNA-Synthese durch Influenza-Polymerase. Natur 516, 361–366 (2014).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Gerlach, P., Malet, H., Cusack, S. & Reguera, J. Strukturelle Einblicke in die Bunyavirus-Replikation und ihre Regulierung durch den vRNA-Promotor. Zelle 161, 1267–1279 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Oymans, J. & Te Velthuis, AJW Ein Mechanismus für das Priming und die Neuausrichtung während der Replikation des Influenza-A-Virus. J. Virol. 92, e01773-17 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

te Velthuis, AJ, Robb, NC, Kapanidis, AN & Fodor, E. Die Rolle der Priming-Schleife bei der RNA-Synthese des Influenza-A-Virus. Nat. Mikrobiol. Rev. 1, 16029 (2016).

Artikel Google Scholar

Killip, MJ, Fodor, E. & Randall, RE Influenzavirus-Aktivierung des Interferonsystems. Virus Res. 209, 11–22 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

te Velthuis, AJW et al. Minivirale RNAs wirken während einer Influenzavirus-Infektion als angeborene Immunagonisten. Nat. Mikrobiol. 3, 1234–1242 (2018).

Artikel Google Scholar

Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y. & Berger, I. MultiBac: Erweiterung der Forschungstoolbox für Multiproteinkomplexe. Trends Biochem. Wissenschaft. 37, 49–57 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Weissmann, F. et al. biGBac ermöglicht eine schnelle Genassemblierung für die Expression großer Proteinkomplexe mit mehreren Untereinheiten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 113, E2564–E2569 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Pardon, E. et al. Ein allgemeines Protokoll zur Erzeugung von Nanokörpern für die Strukturbiologie. Nat. Protokolle 9, 674–693 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Walter, TS et al. Ein Verfahren zum Aufbau von Nanoliter-Kristallisationsexperimenten mit hohem Durchsatz. Kristallisations-Workflow für erstes Screening, automatisierte Lagerung, Bildgebung und Optimierung. Acta Crystallogr. D 61, 651–657 (2005).

Artikel Google Scholar

Kabsch, W. Xds. Acta Crystallogr. D 66, 125–132 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Tickle, IJ et al. STARANISO. http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi (2018).

McCoy, AJ et al. Phaser-Kristallographiesoftware. J. Appl. Kristalllogr. 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr. D 66, 213–221 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr. D 60, 2126–2132 (2004).

Artikel Google Scholar

Smart, OS et al. Ausnutzung der Strukturähnlichkeit bei der Verfeinerung: automatisierte NCS- und Zielstrukturbeschränkungen in BUSTER. Acta Crystallogr. D 68, 368–380 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Rasmussen, SG et al. Kristallstruktur des β2-adrenergen Rezeptor-Gs-Protein-Komplexes. Natur 477, 549–555 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: Anisotrope Korrektur der strahlinduzierten Bewegung für eine verbesserte Kryo-Elektronenmikroskopie. Nat. Methoden 14, 331–332 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Zhang, K. Gctf: Echtzeit-CTF-Bestimmung und -Korrektur. J. Struktur. Biol. 193, 1–12 (2016).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Scheres, SH RELION: Implementierung eines Bayes'schen Ansatzes zur Bestimmung der Kryo-EM-Struktur. J. Struktur. Biol. 180, 519–530 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ & Brubaker, MA cryoSPARC: Algorithmen für die schnelle unbeaufsichtigte Kryo-EM-Strukturbestimmung. Nat. Methoden 14, 290–296 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera – ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse. J. Comput. Chem. 25, 1605–1612 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr. D 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Davis, IW et al. MolProbity: All-Atom-Kontakte und Strukturvalidierung für Proteine und Nukleinsäuren. Nukleinsäuren Res. 35, W375–W383 (2007).

Artikel ADS Google Scholar

Shkumatov, AV & Strelkov, SV DATASW, ein Tool für die HPLC-SAXS-Datenanalyse. Acta Crystallogr. D 71, 1347–1350 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Deng, T., Sharps, J., Fodor, E. & Brownlee, GG Der In-vitro-Zusammenbau von PB2 mit einem PB1-PA-Dimer unterstützt ein neues Modell des Zusammenbaus von Influenza-A-Virus-Polymerase-Untereinheiten zu einem funktionellen trimeren Komplex. J. Virol. 79, 8669–8674 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Fodor, E. et al. Eine einzelne Aminosäuremutation in der PA-Untereinheit der Influenzavirus-RNA-Polymerase hemmt die endonukleolytische Spaltung von verkappten RNAs. J. Virol. 76, 8989–9001 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Fodor, E. et al. Rettung des Influenza-A-Virus aus rekombinanter DNA. J. Virol. 73, 9679–9682 (1999).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fodor, E. & Smith, M. Die PA-Untereinheit ist für eine effiziente nukleare Akkumulation der PB1-Untereinheit des Influenza-A-Virus-RNA-Polymerasekomplexes erforderlich. J. Virol. 78, 9144–9153 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Vreede, FT, Jung, TE & Brownlee, GG Modell, das darauf hindeutet, dass die Replikation des Influenzavirus durch die Stabilisierung replikativer Zwischenprodukte reguliert wird. J. Virol. 78, 9568–9572 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Nilsson-Payant, BE, Sharps, J., Hengrung, N. & Fodor, E. Die oberflächenexponierte PA51–72-Schleife der Influenza-A-Virus-Polymerase ist für die virale Genomreplikation erforderlich. J. Virol. 92, e00687-18 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Schneider, CA, Rasband, WS & Eliceiri, KW NIH Image to ImageJ: 25 Jahre Bildanalyse. Nat. Methoden 9, 671–675 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Robb, NC, Smith, M., Vreede, FT & Fodor, E. Das NS2/NEP-Protein reguliert die Transkription und Replikation des Influenzavirus-RNA-Genoms. J. General Virol. 90, 1398–1407 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Reich, S., Guilligay, D. & Cusack, S. Eine auf Fluoreszenz basierende In-vitro-Studie zur Initiierung der RNA-Synthese durch Influenza-B-Polymerase. Nukleinsäuren Res. 45, 3353–3368 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bussey, KA et al. PA-Rückstände im pandemischen Influenzavirus H1N1 2009 erhöhen die Polymeraseaktivität des Vogelgrippevirus in Säugetierzellen. J. Virol. 85, 7020–7028 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Hu, J. et al. Die durch das PA-Gen vermittelte tödliche Verbreitung und die übermäßige angeborene Immunantwort tragen zur hohen Virulenz des Vogelgrippevirus H5N1 bei Mäusen bei. J. Virol. 87, 2660–2672 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Ilyushina, NA et al. Anpassung pandemischer H1N1-Influenzaviren bei Mäusen. J. Virol. 84, 8607–8616 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Kamiki, H. et al. Eine PB1-K577E-Mutation im H9N2-Influenzavirus erhöht die Polymeraseaktivität und Pathogenität bei Mäusen. Viren 10, 653 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Lee, CY et al. Neuartige Mutationen in Vogel-PA in Kombination mit einer adaptiven Mutation in PR8 NP verstärken die Virulenz von PR8-abgeleiteten rekombinanten Influenza-A-Viren bei Mäusen. Tierarzt. Mikrobiol. 221, 114–121 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Liedmann, S. et al. Neue Virulenzdeterminanten tragen zur verstärkten Immunantwort und verringerten Virulenz einer Variante des Influenza-A-Virus A/PR8/34 bei. J. Infizieren. Dis. 209, 532–541 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Mehle, A., Dugan, VG, Taubenberger, JK & Doudna, JA Neuordnung und Mutation der Polymerase-PA-Untereinheit des Vogelgrippevirus überwinden Artenbarrieren. J. Virol. 86, 1750–1757 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Neumann, G., Macken, CA & Kawaoka, Y. Identifizierung von Aminosäureveränderungen, die für die Entstehung von A(H7N9)-Influenzaviren entscheidend gewesen sein könnten. J. Virol. 88, 4877–4896 (2014).

Artikel Google Scholar

Peng, X. et al. Die Aminosäuresubstitutionen HA A150V, PA A343T und PB2 E627K erhöhen die Virulenz des H5N6-Influenzavirus bei Mäusen. Vorderseite. Mikrobiol. 9, 453 (2018).

Artikel Google Scholar

Slaine, PD et al. Adaptive Mutationen bei Influenza A/California/07/2009 steigern die Polymeraseaktivität und die Produktion infektiöser Virionen. Viren 10, 272 (2018).

Artikel Google Scholar

Wu, R. et al. An der Anpassung des Vogelgrippevirus H9N2 an Mäuse sind mehrere Aminosäuresubstitutionen beteiligt. Tierarzt. Mikrobiol. 138, 85–91 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Xu, G. et al. Die vorherrschende PA-Mutation K356R im Vogelgrippevirus H9N2 erhöht die Replikation und Pathogenität bei Säugetieren. J. Virol. 90, 8105–8114 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Yamaji, R. et al. Adaptive Mutationen des PA-Proteins des hochpathogenen Vogelgrippevirus H5N1 bei Säugetieren. J. Virol. Rev. 89, 4117–4125 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Zhang, Z. et al. Mehrere Aminosäuresubstitutionen sind an der erhöhten Pathogenität von LPAI H9N2 bei Mäusen beteiligt. Infizieren. Genet. Entwicklung 11, 1790–1797 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Zhong, G. et al. Mutationen im PA-Protein von aviären H5N1-Influenzaviren beeinflussen die Polymeraseaktivität und die Virulenz der Maus. J. Virol. 92, e01557-17 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan, YZ et al. Berücksichtigung der bevorzugten Probenorientierung in der Einzelpartikel-Kryo-EM durch Kippen. Nat. Methoden 14, 793–796 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Naydenova, K. & Russo, CJ Messung der Auswirkungen der Partikelorientierung zur Verbesserung der Effizienz der Elektronenkryomikroskopie. Nat. Komm. 8, 629 (2017).

Artikel ADS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken GG Brownlee und F. Vreede für Plasmide; I. Berger für das MultiBac-System; S. Cusack für die Weitergabe und Diskussion unveröffentlichter Daten zur 3′-Promotorbindungsstelle; K. Harlos und T. Walter für Unterstützung bei der Kristallisation; K. Dent und D. Clare für Kryo-EM-Unterstützung; GG Brownlee, D. Stuart und A. te Velthuis sowie Mitglieder der Fodor- und Grimes-Labore für hilfreiche Kommentare und Diskussionen; und Instruct-ERIC, Teil des Europäischen Strategieforums für Forschungsinfrastrukturen (ESFRI), Instruct-ULTRA (EU H2020 Grant 731005) und die Forschungsstiftung Flandern (FWO) für Unterstützung bei der Entdeckung von Nanokörpern. Diese Arbeit wurde durch die Programmzuschüsse des Medical Research Council (MRC) MR/K000241/1 und MR/R009945/1 (an EF), den Wellcome Investigator Award 200835/Z/16/Z (an JMG) und MRC Studentships (an APW) unterstützt ISM) und Wellcome Studentship 092931/Z/10/Z (nach NH). Wir danken Diamond Light Source für die Strahlzeit (Vorschläge MX10627, MX14744 und MX19946) und für den Zugang und die Unterstützung der Kryo-EM-Einrichtungen am britischen National Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) (Vorschläge EM14856 und EM20233), finanziert von der Willkommen, MRC und BBSRC. Weitere Elektronenmikroskopie-Angebote wurden durch die OPIC-Elektronenmikroskopie-Einrichtung bereitgestellt, die durch einen Wellcome JIF-Preis (060208/Z/00/Z) finanziert wurde und durch einen Wellcome-Ausrüstungszuschuss (093305/Z/10/Z) unterstützt wird. Für die Berechnung wurde die Einrichtung Oxford Biomedical Research Computing (BMRC) genutzt, eine gemeinsame Entwicklung des Wellcome Centre for Human Genetics und des Big Data Institute, unterstützt von Health Data Research UK und dem NIHR Oxford Biomedical Research Centre. Die finanzielle Unterstützung erfolgte durch einen Wellcome Trust Core Award (203141/Z/16/Z). Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und nicht unbedingt die des NHS, des NIHR oder des Gesundheitsministeriums. Ein Teil dieser Arbeit wurde durch den Wellcome Administrative Support Grant 203141/Z/16/Z unterstützt.

Itziar Serna Martin

Aktuelle Adresse: Kristall- und Strukturchemie, Bijvoet-Zentrum für biomolekulare Forschung, Abteilung Chemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Utrecht, Utrecht, Niederlande

Narin Hengrung

Derzeitige Adresse: Francis Crick Institute, London, Großbritannien

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Haitian Fan, Alexander P. Walker, Loïc Carrique, Jeremy R. Keown

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Jonathan M. Grimes, Ervin Fodor

Sir William Dunn School of Pathology, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Haitianischer Fan, Alexander P. Walker, Itziar Serna Martin, Jane Sharps, Narin Hengrung und Ervin Fodor

Abteilung für Strukturbiologie, Wellcome Centre for Human Genetics, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Loïc Carrique, Jeremy R. Keown, Itziar Serna Martin, Dimple Karia, Narin Hengrung und Jonathan M. Grimes

VIB–VUB Zentrum für Strukturbiologie, VIB, Brüssel, Belgien

Ich vergebe ihnen

Strukturbiologie Brüssel, Vrije Universiteit Brussel, Brüssel, Belgien

Jan Steyaert

Diamond Light Source, Didcot, Großbritannien

Jonathan M. Grimes

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

HF, APW, LC, JRK, JMG und EF haben die Studie konzipiert und gestaltet. HF, LC, JRK und NH führten die Klonierung rekombinanter Baculoviren und die Proteinreinigung durch. HF und JRK führten Kristallisationen, Datenerfassung und -analyse sowie Modellbildung und -verfeinerung durch. LC und JRK sammelten und verarbeiteten elektronenmikroskopische Daten und erstellten und verfeinerten Modelle mit Unterstützung von DK und ISMAPW, führten Funktionstests durch und analysierten Daten. J. Sharps führte Dimerisierungstests in Säugetierzellen durch und EF analysierte die Daten. EP und J. Steyaert entwarfen und erzeugten Nb8205 und Nb8210, und NH führte die Expression und Reinigung von Nanokörpern durch. JMG und EF überwachten die Struktur- bzw. Funktionsstudien. HF, APW, LC, JRK, JMG und EF haben das Manuskript mit Beiträgen aller Co-Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Jonathan M. Grimes oder Ervin Fodor.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers: Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Informationen zum Peer-Review Nature dankt Seth Darst, Achilleas Frangakis und Peng Gong für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

a, b, Ansichten der Struktur von FluPolA-Heterotrimeren des menschlichen H3N2 (a) und des aviären H5N1 (b), gefärbt nach Untereinheit. c–e, Strukturen der menschlichen H3N2-FluPolA-Untereinheiten PA (c), PB1 (d) und PB2 (e), gefärbt und nach Domäne markiert. f, Domänenkarten jeder der H3N2-FluPolA-Untereinheiten. g–i, Die 2D-Fo-Fc-Elektronendichtekarten der FluPolA-Dimer-Schnittstelle, wie in Abb. 1c (g, Stereoansicht) und Abb. 1d (h, Stereoansicht) gezeigt, sowie des vollständigen FluPolA-Dimers (i) werden in grauem Netz dargestellt (konturiert bei 1,5σ, alle aus dem Strukturmodell von H3N2 FluPolA).

a, SEC-MALS-Analyse der Wildtyp- und PA(352–356A)-Mutante H3N2 FluPolA (n = 1 Experiment). Glatte Linien spiegeln das relative UV-Signal von SEC wider und gepunktete Linien geben die geschätzte Molekülmasse für jedes Bild an. Beachten Sie, dass das monomere FluPolA-Heterotrimer eine ungefähre Molekularmasse von 255 kDa hat. b: Auswirkung der PA(352–356A)-Mutation auf die FluPolA-Dimerisierung in HEK293T-Zellen. Die Daten sind Mittelwerte ± Sem n = 3 unabhängige Transfektionen. Einweg-ANOVA. P < 0,05 gilt als signifikant. c, Wirkung von Mutationen zur Destabilisierung von PB2 und PA-Schleifen an der FluPolA-Dimer-Schnittstelle auf die FluPolA-Aktivität in einem viralen RNP-Rekonstitutionstest. Die Daten sind Mittelwerte ± Sem n = 3 unabhängige Transfektionen. Zweifaktorielle ANOVA. P < 0,05 gilt als signifikant. d, e, Wirkung der PA(352–356A)-Mutation auf die In-vitro-ApG-Primer-Replikation durch FluPolA auf einer vRNA- (d) und cRNA-(e)-Matrize. f, Wirkung einer Mutante der Polymerase im aktiven Zentrum (PB1a) auf die In-vitro-ApG-Primer-Replikation durch FluPolA auf einer cRNA-Matrize. Die Daten sind Mittelwerte ± Sem n = 4 unabhängige Reaktionen. g: Das Weglassen von UTP bei der In-vitro-ApG-Primer-Replikation durch FluPolA auf einer cRNA-Matrize wirkt sich auf die Synthese der 15-Nukleotid-vRNA in voller Länge aus, nicht jedoch der 12-Nukleotid-Kurz-vRNA, was darauf hinweist, dass das 12-Nukleotid-Produkt vorhanden ist abgeleitet von der internen Initiierung durch das ApG-Dinukleotid an den Positionen 4 und 5 der cRNA-Matrize. Die Position in der Vorlage, an der UTP erforderlich ist, ist rot markiert. Repräsentative Daten von n = 2 unabhängigen Reaktionen. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 2.

a, Repräsentative mikroskopische Aufnahme von cRNA-gebundenen FluPolA-Heterotrimer-Partikeln, eingebettet in Glaskörpereis. b, Repräsentative 2D-Klassendurchschnitte. c: Fourier-Shell-Korrelationskurven (FSC) für die 3D-Rekonstruktion unter Verwendung der Goldstandard-Verfeinerung in RELION, was eine Gesamtkartenauflösung von 4,07 Å und die Modell-zu-Karte-FSC anzeigt. Es werden Kurven für phasenrandomisierte, unmaskierte, maskierte und phasenrandomisierungskorrigierte maskierte Karten angezeigt. d, Eine 3D-Rekonstruktion, lokal gefiltert und entsprechend der lokalen RELION-Auflösung gefärbt. e, Winkelverteilung der Partikelprojektionen mit der grau dargestellten Kryo-EM-Karte. f, Kryo-EM-Dichte der PA-Schleife 352–356 an der Dimer-Grenzfläche. g, Kryo-EM-Karte des cRNA-gebundenen FluPolA-Dimers, verfeinert ohne auferlegte Symmetrie (C1), die eine zusätzliche Dichte (grün) zeigt, die sich neben dem 3'-Ende der 5'-cRNA in der Nähe des Matrizeneintrittskanals befindet. h, Nahaufnahmen, die die zusätzliche Dichte in der Kryo-EM-Karte (dunkelgrün) hervorheben, wobei der 3′-vRNA-Strang aus der überlagerten FluPolB-Struktur51 (PDB 5MSG, hellgrün) in das aktive Zentrum der Polymerase eingefügt wird. Die Lokalisierung der 3′-vRNA zeigt, dass Basen in der zusätzlichen Dichte positioniert sind, gegenüber der Dichte, die dem 3′-Ende der 5′-cRNA entspricht. Dies deutet auf das Vorhandensein einer Promotor-RNA-Duplexregion hin, wie sie in der vRNA-gebundenen FluPolB-Struktur51 beobachtet wird. Die zusätzliche Dichte steht im Einklang mit dem Vorhandensein einer 3′-cRNA in einem der Heterotrimere des cRNA-gebundenen FluPolA-Dimers, die auf das aktive Zentrum der Polymerase ausgerichtet ist.

a, SDS-PAGE von gereinigten Nanokörpern (n = 1 Experiment). b, Analytische SEC von FluPolA im Komplex mit Nanokörpern (n = 4 Experimente für Nb8205 und n = 2 Experimente für Nb8210, mit ähnlichen Ergebnissen). c, Wirkung von Nanokörpern auf die FluPolA-Dimerisierung in HEK293T-Zellen. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM n = 4 unabhängige Transfektionen. Einweg-ANOVA. P < 0,05 gilt als signifikant. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 2. d, Kristallstruktur von H3N2 FluPolA im Komplex mit Nb8205. e, Nahaufnahme der FluPolA-Nb8205-Wechselwirkungen. Reste, die an Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind, sind markiert und Wasserstoffbrückenbindungen sind mit gestrichelten Linien gekennzeichnet. Die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) sind einzeln eingefärbt und beschriftet.

a, Repräsentative mikroskopische Aufnahme von cRNA-gebundenem FluPolA im Komplex mit Nb8205, eingebettet in Glaskörpereis. b, Repräsentative 2D-Klassendurchschnitte. c, FSC-Kurven für die 3D-Rekonstruktion unter Verwendung der Goldstandard-Verfeinerung in RELION, was eine Gesamtkartenauflösung von 3,79 Å bzw. 4,15 Å für die monomere bzw. dimere FluPolA-Form und die Modell-zu-Karte-FSC anzeigt. Es werden Kurven für phasenrandomisierte, unmaskierte, maskierte und phasenrandomisierungskorrigierte maskierte Karten angezeigt. d, f, Die 3D-Rekonstruktionen, lokal gefiltert und entsprechend der lokalen RELION-Auflösung gefärbt, für die dimere (d) und die monomere (f) Form. e, g, Winkelverteilung der Partikelprojektionen für die dimere (e) und die monomere (g) Form, wobei die Kryo-EM-Karte in Grau dargestellt ist. h, Dimer von FluPolA-Heterotrimeren, gebunden an cRNA-Promotor und Nb8205-Starrkörper, eingepasst in die Kryo-EM-Karte des dimeren cRNA-gebundenen FluPolA-Heterotrimers im Komplex mit Nb8205. i, Kryo-EM-Karte des dimeren cRNA-gebundenen FluPolA-Heterotrimers im Komplex mit Nb8205, die eine zusätzliche Dichte (grün) neben dem 3′-Ende der 5′-cRNA zeigt (wie auch für das cRNA-gebundene FluPolA-Dimer beobachtet); Erweiterte Daten Abb. 3g, h).

a, Repräsentative mikroskopische Aufnahme von cRNA-gebundenen FluPolB-Heterotrimer-Partikeln, eingebettet in Glaskörpereis. b, Repräsentative 2D-Klassendurchschnitte. c, Eine 3D-Rekonstruktion, lokal gefiltert und entsprechend der lokalen RELION-Auflösung gefärbt. d, FSC-Kurven für die 3D-Rekonstruktion unter Verwendung der Goldstandard-Verfeinerung in RELION, was eine Gesamtkartenauflösung von 4,18 Å und den Modell-zu-Karte-FSC anzeigt. Es werden Kurven für die Phasenrandomisierungs-, unmaskierten, maskierten und phasenrandomisierungskorrigierten maskierten Karten angezeigt. e, Winkelverteilung der Partikelprojektionen gemäß der ungleichmäßigen Verfeinerung von cryoSPARC v.2.5. f, Kryo-EM-Karte von cRNA-gebundenem FluPolB. g, Vergleich der Dimerisierungsschnittstelle und der 3ʹ-cRNA-Bindungsstelle in H3N2 FluPolA (PDB 6QNW und 6QPG). h, die 3'-cRNA-Bindungsstelle in FluPolA und FluPolB überlappt mit der zuvor identifizierten 3'-vRNA-Bindungsstelle in der La Crosse-Orthobunyavirus-Polymerase19 (PDB 5AMQ). Zum Vergleich sind die Stellen der 3′-vRNA-Bindung an der Oberfläche der Polymerase in FluPolB (PDB 4WRT) und im aktiven Zentrum der Polymerase für FluPolB (PDB 5MSG) dargestellt6,51. i: Ein Vergleich der Struktur von dimerem FluPolA mit monomerem FluPolB (PDB 5MSG)51 zeigt eine Bewegung der Priming-Schleife, die von der Daumen-Subdomäne von PB1 in das aktive Zentrum der Polymerase hineinragt. Aufgelöste PB1-Reste, die der Spitze der Priming-Schleife am nächsten liegen (Reste E638 und M656), entfernen sich um etwa 7 Å von den entsprechenden E637- und M655-Resten in FluPolB und dem aktiven Zentrum der Polymerase (angezeigt durch das Ende der 3′-vRNA).

a, Repräsentative mikroskopische Aufnahme vRNA-gebundener FluPolA-Heterotrimer-Partikel, eingebettet in Glaskörpereis. b, Repräsentative 2D-Klassendurchschnitte. c, FSC-Kurven für die 3D-Rekonstruktion unter Verwendung der Goldstandard-Verfeinerung in RELION, was eine Gesamtkartenauflösung von 3,01 Å und den Modell-zu-Karte-FSC anzeigt. Es werden Kurven für phasenrandomisierte, unmaskierte, maskierte und phasenrandomisierungskorrigierte maskierte Karten angezeigt. d, Eine 3D-Rekonstruktion, lokal gefiltert und entsprechend der lokalen RELION-Auflösung gefärbt. e, Winkelverteilung der Partikelprojektionen mit der grau dargestellten Kryo-EM-Karte. f, Kryo-EM-Karte des vRNA-gebundenen FluPolA-Heterotrimers, die das Vorhandensein einer vollständig aufgelösten Priming-Schleife zeigt. g, Nahaufnahmen, die die Stapelung der 3′-vRNA durch die Priming-Schleife hervorheben. h, Karikatur der Rolle der Polymerase-Dimerisierung bei der Matrizen-Neuausrichtung während der Replikationsinitiierung auf einer cRNA-Matrize. Durch die Basenpaarung zwischen den 5′- und 3′-cRNAs werden die Basen 4 und 5 der 3′-cRNA neben den katalytischen Aspartaten (Reste D445 und D446 von PB1) im aktiven Zentrum positioniert, um die interne Replikationsinitiierung durch die Synthese eines pppApG-Dinukleotids zu ermöglichen . Die Priming-Schleife stapelt die cRNA-Matrize über P651 von PB1 (links). Die durch die Polymerase-Dimerisierung ausgelöste Drehung der Daumen-Subdomäne von PB1 und der N1-Subdomäne von PB2 führt zu einer Bewegung der Priming-Schleife und einem Zurückverfolgen der gestapelten Matrize (Pfeile). Das Zurückverfolgen wird auch durch eine Wechselwirkung des Rests R46 von PB2 mit der 3′-cRNA erleichtert, die einen „Knick“ in die Matrize einführt. Durch Zurückverfolgen werden die Basen 1 und 2 der cRNA-Matrize gegenüber dem pppApG-Dinukleotid positioniert, das weiterhin von den katalytischen Aspartaten koordiniert wird. Der resultierende Replikationskomplex ist bereit, das pppApG-Dinukleotid zu verlängern, indem er das nächste eingehende NTP einbaut (rechts).

a, b, Wirkung von Nb8205 auf die In-vitro-ApG-Primer-Replikation durch FluPolA auf einer vRNA- (a) und cRNA-(b)-Matrize. Die Daten sind Mittelwerte ± Sem n = 3 unabhängige Reaktionen. c: Das Weglassen von UTP bei der In-vitro-ApG-Primer-Replikation durch FluPolA auf einer cRNA-Matrize wirkt sich auf die Synthese der 15-Nukleotid-vRNA voller Länge aus, nicht jedoch der 12-Nukleotid-Kurz-vRNA. Die Position in der Vorlage, an der UTP erforderlich ist, ist rot markiert. Repräsentative Daten von n = 2 unabhängigen Reaktionen. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 2. d, Kristallstruktur von H3N2 FluPolA mit Aminosäureresten, die an der Adaptation von Influenza-A-Viren von Vogel zu Säugetier beteiligt sind52,53,54,55,56,57,58,59 ,60,61,62,63,64,65,66.

Diese Datei enthält ergänzende Abbildungen 1-2. Ergänzende Abb. 1 Sequenzähnlichkeit von FluPol aus verschiedenen Influenzavirus-Gattungen. ac, Sequenzalignment der Polymerase-Untereinheiten PA (a), PB1 (b) und PB2 (c) aus A/NT/60/1968 (H3N2), A/duck/Fujian/01/2002 (H5N1), A/bat/ Guatemala/060/2010 (H17N10), B/Panama/45/1990 und C/Johannesburg/1/1966. Reste, die an Wasserstoffbrückenbindungen an der FluPolA-Dimer-Schnittstelle beteiligt sind, sind in Cyan dargestellt, Reste, die an der Bindungsstelle des 3′-cRNA-Promotors beteiligt sind, sind in Orange dargestellt und Reste, die an der Bindung von Nb8205 beteiligt sind, sind in Rosa dargestellt. Die Abbildung wurde mit Espript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi) erstellt. Ergänzende Abb. 2 Quelldaten (Gele). a, Quelldaten für die Hauptfiguren. b, Quelldaten für erweiterte Datenzahlen.

Struktur von menschlichem H3N2 FluPolA, gebunden an cRNA und Nb8205. Dieses Video zeigt eine Nahaufnahme der 3′-cRNA-Bindungsstelle.

Vergleich von monomeren und dimeren FluPolA-Strukturen im Komplex mit Nb8205. Das Video zeigt, dass die Dimerisierung eine Bewegung eines helikalen Bündels induziert, das aus den PB1-Daumen- und PB2-N1-Subdomänen besteht. Die Dimerisierung führt zur Öffnung der 3′-cRNA-Bindungsstelle, die mit der 3′-cRNA-Bindung nicht kompatibel ist.

Vergleich der Struktur von dimerem FluPolA mit monomerem FluPolB (PDB: 5MSG). Vergleich der Struktur von dimerem FluPolA mit monomerem FluPolB (PDB: 5MSG).

Vergleich der Struktur von dimerem FluPolA mit monomerem vRNA-gebundenem FluPolA. Dieses Video zeigt die durch Dimerisierung ausgelöste Bewegung der Priming-Schleife im aktiven Zentrum der Polymerase.

Nachdrucke und Genehmigungen

Fan, H., Walker, AP, Carrique, L. et al. Strukturen der RNA-Polymerase des Influenza-A-Virus bieten Einblicke in die Replikation des viralen Genoms. Natur 573, 287–290 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1530-7

Zitat herunterladen

Eingegangen: 12. März 2019

Angenommen: 07. August 2019

Veröffentlicht: 04. September 2019

Ausgabedatum: 12. September 2019

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-019-1530-7

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Naturkommunikation (2023)

Wissenschaftliche Berichte (2023)

Naturstruktur- und Molekularbiologie (2023)

Naturkommunikation (2022)

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.